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茜素红能和许多金属离子生成稳定的红色络色物，在分析中常用作金属指示剂；也可以作为酸碱指示剂，其第一变色范围pH值3.7（黄）～5.2（紫），第二变色范围pH值10.1（紫）～12.0（浅黄）。

茜素红S（Alizarin Red S）染色试剂中的茜素红S可通过与钙离子和其他金属离子发生鳌和反应而形成可以在显微镜下直接观察的带颜色的复合物。本产品就是基于此原理而开发。

• 即开即用，用户不需要单独准备各种溶液。
  
• 操作简捷，性能稳定，显色清晰。
  
• 可用于组织切片中的钙沉积，尤其适用于骨细胞或组织的病理和生理研究。
  
• 可用于检测动物原生代或培养细胞的钙沉积。
  
• 本产品为通用型，不但用于钙离子的检测，还可用于FeCl2和CdCl2的检测。
  
• 本产品只能用于科研。

1. 根据所需检查的金属离子按下表选择茜素红S染色液的最佳pH。
   

   金属离子	最佳pH	呈现的颜色
   CaCl2，CaPO4、CaCO3	4.28-6.75	橙红
   FeCl2	5.62-8.05	深紫
   CdCl2	5.11-5.78	品红

   
   
2. 用茜素红S pH调节液将茜素红S染色液调到所需的pH值。

3. 用自备的缓冲中性福尔马林、福尔马林-乙醇混合液或乙醇作为固定剂固定铺在载玻片上的细胞（本试剂盒不提供上述固定剂）。
   
4. 将细胞放入95%乙醇中处理。
   
5. 将载玻片在空气中干燥。
   
6. 将载玻片放在装有茜素红S染色液的染色缸中染色1～5分钟。
   注意：此步需要密切控制，最好每隔一分钟放在显微镜下检测，最佳时间随样品中盐离子的多少不同而不同。
   
7. 用蒸馏水洗涤载片一次。
   
8. 用自备的丙酮浸泡载波片30秒。
   
9. 用自备的丙酮-二甲苯混合液（50：50）浸泡浸泡载波片15秒。
   
10. 肉眼可见红色或紫色（取决于所检查的离子）即可终止染色，放光学显微镜观察。钙沉积阳性细胞将呈现桔红色。

11. 按常规方法进行固定、包埋、切片、脱蜡和水化等操作，直到70%乙醇处理这步。
    注意：固定剂最好使用4%的副甲醛或10%福尔马林，切片厚度最好在0.4μm。本试剂盒不含相关试剂。
    
12. 将切片浸入蒸馏水中。
    
13. 将切片浸泡在茜素红S染色液中30秒～5分钟，具体时间以肉眼或显微镜下可见桔红色斑点为准。
    
14. 用滤纸吸尽染色液后浸入自备的丙酮20次。
    
15. 再进入自备的丙酮-二甲苯混合液（50：50）20次。
    
16. 最后用自备的二甲苯处理并用封固剂封片。

17. 小心抽去培养液，注意不要吸走细胞。
    
18. 沿壁上缓慢加入1～2mL自备的1×PBS或HBSS缓冲液，然后再小心将加入的液体吸出。
    
19. 每孔中加入自备的无水乙醇直到全部覆盖细胞，室温放置30分钟后小心移弃无水乙醇，室温晾干。此步用于固定细胞。也可用10%甲醛代替无水乙醇，但固定时间只需要15分钟。
    
20. 每次洗涤时，先加入蒸馏水，再浸泡5～10分钟，然后小心吸走蒸馏水。
    注意：操作时不要破坏细胞单层。
    
21. 再重复上步的蒸馏水洗涤两次。共洗涤三次。
    
22. 每个细胞培养孔中加入1mL茜素红S染色液，在室温下孵育至少20分钟，最后小心吸走茜素红S染色液。
    
23. 加入1mL蒸馏水，然后小心吸走蒸馏水。此为洗涤步骤。
    注意：洗涤一定不要震荡以避免形成的钙沉积物脱落。
    
24. 重复上步操作3次（共洗涤4次）。
    
25. 样品可立即用于显微镜检测。有钙沉积的细胞将呈现桔红色。